陈瑶副教授课题组：利用链置换扩增结合DNAzyme催化裂解分子标循环反应用于碱性磷酸酶的荧光检测

碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是一种广泛存在于人体各组织器官的一类功能酶的统称，它能特异性地将裸露的磷酸酯键水解成游离的磷酸根离子，对于调节人体环境中酸度平衡起到一定的作用。其具有广泛的水解底物，因此参与了许多人体中重要的反应。碱性磷酸酶虽在人体分布广泛，但主要存在于肝、肾、骨骼、小肠、胎盘等组织中。在青少年生长期，由于成骨过程对磷酸根离子需求量大，因此碱性磷酸酶浓度较高，成骨完毕后水平才会较成人一致。经研究发现，异常的碱性磷酸酶浓度可作为许多疾病的诊断指标，如肝磷酸酶浓度异常与阻塞性黄疸、胆汁淤积性肝炎、原发性肝癌和继发性肝癌等疾病有关；肾磷酸酶浓度异常与肾病、严重性贫血等有关；人体血清中该酶主要来源为骨骼细胞，血清中异常的碱性磷酸酶浓度与许多骨骼疾病如佝偻病、软骨症、骨细胞癌、骨质疏松等疾病有关。鉴于碱性磷酸酶的重要生理意义，因此对于碱性磷酸酶浓度的检测具有医疗和临床诊断的重要意义。

论文作者设计了一个在5’末端和3’末端分别修饰FAM基团和猝灭基团的分子信标探针，并在其环的部位修饰了一个RNA碱基，这个结构能被DNAzyme识别并切割。正常条件下在缓冲液中由于碱基互补相互作用，荧光基团和猝灭基团彼此相互靠近，荧光被猝灭。引物链的3’末端进行了磷酸化修饰，在正常条件下，聚合酶无法识别磷酸化位点，链置换扩增反应无法进行，无法生成DNAzyme，因此后续反应无法进行。在碱性磷酸酶存在下，引物链的3’端磷酸基团被水解，链置换扩增反应得以进行，生成大量DNAzyme并催化切割分子信标结构。分子信标结构在被切割后，荧光和猝灭基团将分开，荧光得以恢复，如图1所示。荧光信号的强弱与体系中碱性磷酸酶的浓度存在一定线性关系，可用于对碱性磷酸酶进行定量分析。

图1 荧光探针结合DNAzyme法检测碱性磷酸酶浓度原理图

为了确保该实验设计方案可用于碱性磷酸酶浓度的检测，进行了一系列实验用以验证。分别剔除某一反应物，在反应步骤不变的前提下，行进了一系列对比实验，另通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对实验可行性进行了进一步的确认。图2左：在所有反应物都存在时（红色实线）以及分别剔除单一反应物和只有探针（其他实线）时每个反应体系的荧光光谱。各反应物浓度或含量分别为：碱性磷酸酶2.5 U/L，磷酸化引物链10 nM，扩增模板链10 nM，DNA聚合酶3 U，切刻内切酶7.5 U，分子信标荧光探针100 nM，dNTPs浓度为0.2 mM。图2右为电泳结果，条带1：mark条带；条带2：分子信标探针；条带3：不加碱性磷酸酶；条带4：不加引物链；条带5：不加模板链；条带6：加入所有试剂；条带7：DNAzyme和探针。各试剂浓度分别为：50 U/L碱性磷酸酶，100 nM引物链和模板链，2 μM探针。从图中可以看出，无论是验证体系荧光光谱结果还是聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，该反应体系对于碱性磷酸酶浓度的检测都呈现了令人满意的结果，故可认定该反应体系的可行性。

图2 可行性实验荧光光谱图以及聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图

该方法对ALP的定量线性范围为0.050 - 0.75 U/L。且对ALP检测具有高特异性，其他干扰蛋白或酶对荧光信号几乎无影响。最后利用碱性磷酸酶标准样建立的荧光定量分析模对血清中碱性磷酸酶浓度进行定量，并将定量结果与试剂盒测量结果进行对比，这两种方案对实际血清的预测结果相差不大，说明荧光定量分析模型有效地消除了实际体系中干扰物质所带来的误差影响。方法检测限为0.015 U/L，低于文献中报道的一些方法。

综上，该方法具有高特异性、灵敏度、准确性和良好的重复性，可用于复杂生物样品中 ALP 的定量检测，有望成为生物样品中 ALP 定量的有竞争力的工具。 

唐英博士为本文的通讯作者，陈瑶副教授为第一作者。该研究得到了国家自然科学基金委、湖南省自然科学基金委研究项目等的经费支持。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1386142523006698